文|百仗漈

编辑|百仗漈

?○●—【前言】—●○?

赖氨酸氧化酶（LOXs）是一种依赖铜和赖氨酸酪醌（LTQ）的胺氧化酶，催化细胞外基质（ECM）蛋白如弹性蛋白和胶原蛋白的赖氨酸残基的氧化脱氨，并产生醛基，赖氨酸的氧化脱氨代表了弹性蛋白和胶原蛋白交联的基础步骤，因此对ECM的建模至关重要。

尽管它们具有生理意义，但这个重要的酶家族的结构仍然难以确定，在这里，我们讨论了人类赖氨酸氧化酶样2（hLOXL2）的晶体结构，分辨率为2.4?，出乎意料的是，hLOXL2的铜结合位点被锌占据，这阻碍了LTQ的生成和hLOXL2在体外实验中的酶活性。

生物化学分析证实，铜的负载有力地激活了hLOXL2并支持LTQ的形成，此外，该结构中的LTQ前体残基相距16.6埃，证实了目前的结构可能代表一种前体状态，并且蛋白质的激活需要明显的构象重排，而我们介绍的结构为理解LOX蛋白的结构-功能关系奠定了重要基础，并将促进LOX靶向药物的发现。

细胞外基质（ECM）

细胞外基质（ECM）为常驻细胞提供结构和化学支持，从而调节各种细胞功能，如细胞粘附、交流、基因表达和迁移，胶原蛋白和弹性蛋白是ECM的主要结构蛋白，从分子间交联开始，它们逐渐组合成一个与不同组织相适应的功能网络。

ECM蛋白的交联是由赖氨酸氧化酶（LOX）启动的，LOX家族包括五种分泌酶，催化胶原蛋白和弹性蛋白上的赖氨酸和羟基赖氨酸残基的ε-氨基的氧化脱氨，产生高活性的醛，自发地与邻近的醛或ε-氨基缩合，形成高阶交联。

由于其在ECM形成中的重要功能，LOX蛋白的缺乏导致结缔组织发育的严重失调，在不同的组织中还发现了另外四种类似赖氨酸氧化酶的蛋白，尽管它们在体内的具体功能和底物偏好仍有待于阐明。

越来越多的证据表明，LOX蛋白与各种人类疾病，如组织纤维化和几种类型的癌症之间的关系，纤维化疾病的特点是ECM纤维的逐渐过度生产，最终导致器官功能障碍，组织病理学研究表明，LOX蛋白在纤维化的肺部和肝脏中异常聚集，这与它们在ECM模型中的作用一致。

针对LOXL2的抑制试验显示，在动物模型中，纤维化的进展有所改变，同时伴有肌成纤维细胞的减少，血清LOXL2水平与特发性肺纤维化的疾病进展有关，使其成为潜在的诊断生物标志物。

也有人认为LOX蛋白与乳腺肿瘤的进展有关联，LOX和LOXL2在转移性乳腺肿瘤中特异性表达，并诱导非侵入性癌症的转移率升高，针对LOX和LOXL2的抑制试验导致培养细胞和动物模型的肿瘤迁移减少。

LOX蛋白和2,4,5-三羟基苯丙氨酸醌（TPQ）依赖的含铜胺氧化酶（CAO）代表了含铜和醌的胺氧化酶的两个主要家族，LOX蛋白除了催化肽基赖氨酸的氧化脱氨外，还催化小分子胺。

而大多数CAO识别小分子胺，只有少数特定的CAO能与肽基赖氨酸一起工作，尽管它们有不同的底物偏好，但这两个家族都利用共价连接的醌辅助因子来催化一级胺的脱氨。

该辅助因子来自本地残基的翻译后修改，LOX和CAO家族的醌生成，在有氧条件下是一个自我催化的过程，需要一个紧密结合的铜离子作为辅助因子。

通过系统的晶体学和生物化学研究，CAO的工作机制已基本得到阐明，尽管LOX家族在ECM建模和多种疾病关系中起着基本作用，但其结构仍然难以捉摸，序列分析表明，LOX和CAO家族没有明显的同源性，LOX家族成员有不同的N端结构域，然后是一个保守的催化结构域。

LOX和LOXL1含有一个N端前肽，在蛋白质成熟过程中通过ECM中的蛋白酶裂解被去除，LOXL2-4分别由四个富含半胱氨酸的清道夫受体（SRCR）结构域组成，这被认为是介导细胞表面和ECM蛋白的相互作用。

LOX蛋白的催化结构包含铜结合基团和功能性醌基，该基团已被确定为赖氨酸和酪氨酸残基之间通过翻译后交联产生的赖氨酸酪氨酸醌（LTQ），有人提出LOXs的工作机制与CAO家族相似。

然而，它们的催化结构域之间的远距离同源性表明LOX蛋白的结构组织可能不同，这可能赋予LTQ形成和底物识别的不同机制。

在此，我们以2.4?的分辨率展示了人类LOXL2在锌结合前体状态下的晶体结构，这为LOX蛋白的结构-功能关系的机制研究建立了框架。

人类LOXL2的整体结构

蛋白质制备和结晶的细节可以在材料和方法中找到，简而言之，人LOXL2（hLOXL2）残基26-774，包括四个N端SRCR结构域和催化结构域，在哺乳动物HEK293F细胞中瞬时表达并分泌到培养基中，hLOXL2-N455Q在HEK293F系统中分泌良好。

尽管以前有报告说Asn455的糖基化对hLOXL2在果蝇S2表达系统中的分泌很重要，对纯化的蛋白进行有限的蛋白分解，得到一个由第三和第四SRCR结构域和完整的催化结构域组成的片段。

为了确保蛋白质的均一性并简化蛋白质的纯化，我们在残基318之前设计了一个特定的caspase DrICE切割点，裂解后的片段，经过进一步纯化，产生了良好的衍射晶体。

该结构是通过分子置换和基于锇的单波长反常色散（Os-SAD）的组合来解决的，建立了由残基322-762组成的原子模型，并将其细化到2.4?的分辨率。

在每个不对称单元（ASU）中，观察到两个hLOXL2分子，它们几乎是叠加的，rmsd为0.80 ?，分子间结合主要是通过SRCR4域介导的，在很小的程度上，通过SRCR4和对立的SRCR3，在SRCR3和SRCR4之间已经观察到稀疏的分子间氢键（H-bonds），尽管观察到单个ASU中有两个分子，但hLOXL2在溶液中被显示为单体状态。

hLOXL2的整体结构呈现出三角形，SRCR3、SRCR4和催化结构域各占三角形的一个角，在LOXL2-4中保守的N-连接糖，位于三角平面外围的催化结构域上，所有22个半胱氨酸残基都参与了二硫键，分布在整个结构中，稳定了局部构象。

A组SRCR结构域的特点是有三个保守模式的二硫键，hLOXL2的第三和第四个SRCR结构域与人类Mac-2结合蛋白（M2BP-SRCR）的结构排列显示出明显的相似性。

所有的结构都显示出相同的二硫键模式和类似的折叠，其特点是一个由β线包围的α螺旋，证实了hLOXL2的SRCR结构域属于A组的预测。

在已解决的结构中，SRCR4结构域没有显示出与催化结构域的联系，只是通过SRCR3上的Tyr333和SRCR4上的Gly481和Glu545之间的H键与SRCR3接触。

相反，9个H型键介导SRCR3和催化结构域之间的广泛相互作用，SRCR3上的Gln383和Gly331与催化结构域上的Asn606和Gln608形成了三个H键，而另外六个是在SRCR3上的Gly345/Arg327/Trp347和催化结构域C端的Ser753/Gly750/Ser751/Phe752之间形成的，涉及主链和侧链。

催化域的结构

hLOXL2的催化域包含14个β-链和3个α-螺旋体，根据蛋白质数据库（PDB）对催化域结构进行DALI搜索，得到了一个具有不同功能的蛋白质列表，得分最高的结构是来自双歧杆菌的β-半乳糖苷酶的结构，根据结构比对，可叠加和不重叠的区域分别被定义为核心段和额外段。

核心呈现出由三个β-片构成的三明治结构，其中最大的一个由β8、7、12、13和14组成，Cys732和Cys746之间的二硫键有助于稳定这个β-片的一个边缘，由β2、3和11以及β1、4、10和9分别形成的两个较小的β片被α1和灵活的环路所干预。

Cys663和Cys685之间的二硫键将β9的末端与β10固定在一起，β10上有Tyr689，是LTQ的关键前体残基之一，β8和β9之间以及β9和β10之间有两个灵活的环，它们由Cys673和Cys657之间的另一个二硫桥连接。

一个球状的密度被β1和β12和β13之间的环所包围，由LOX家族中六个高度保守的残基的氧所协调： Asn727, Asn728, Asp724, Glu722, Asp549, 和Leu550，这种八面体配位模式与结合的钙离子一致，它可能在局部结构稳定中发挥作用。

在围绕催化结构域核心的三个ES段中，ES1包含一个弯曲的α螺旋（α2），它通过Cys579和Cys695之间的二硫桥与核心连接，ES2的主要结构元素是一个β发夹，它容纳了高度保守的铜结合图案。

ES2通过Cys625和Cys573与ES1二硫键连接，这可能会稳定这个关键的β发夹，ES3位于催化域的C端，负责与SRCR3域的相互作用。

人类LOX家族成员拥有一个保守的催化结构域，序列比对显示ES1、ES2和结构核心的大部分区域具有高度的保守性，这意味着LOX蛋白之间具有类似的结构，这在ConSurf图中有所表现。

值得注意的是，涉及LTQ前体和铜结合图案的hLOXL2的假定活性位点在LOX家族中异常保守，这与它们在功能中的关键作用相一致。

hLOXL2的铜结合位点被锌所占据

在预测的铜结合位点中明确地观察到了电子密度，表明了金属离子的存在，尽管在整个蛋白质的表达、纯化和结晶过程中铜被排除在外，为了确定结合的金属，收集了数百个hLOXL2晶体，仔细清洗，溶解，并进行了元素分析。

晶体衍生的hLOXL2确实不含铜，但含有大量的锌，可能来自哺乳动物细胞介质，在锌和铜的边缘对hLOXL2晶体进行荧光扫描，得到了一致的结果。

为了进一步证实锌离子在该部位的结构分配，对结合部位的残基进行了突变，并对所得突变体进行了元素分析，检测到锌含量减少，证实了铜结合位点在结构中被锌占据。

在hLOXL2结构中，锌被His626、His628、His630和Tyr689的侧链协调，表现出四面体的几何结构，其中，Tyr689是LTQ的前体之一，在与锌或铜结合的CAO的apo结构中，金属离子被三个His残基和TPQ的前体酪氨酸以类似的几何形状结合，表明前体LOX和apo CAO之间的金属配合是保守的。

hLOXL2的结构代表了锌结合的前体状态

以前的研究已经确定了铜在LTQ生成中的重要作用，因此，锌对铜结合位点的占领可能会抑制醌的生成，并阻止hLOXL2处于前体状态，正如实验表明的CAO蛋白。

为了验证这一假设，我们在锌结合的hLOXL2中进行了离子交换，并调查了加载铜的蛋白质的酶活性和LTQ的生成，由于糖基化突变N455Q似乎对hLOXL2的酶活性没有影响，除非另有说明，此后描述的所有蛋白变体都包含这一单点突变。

正如预期的那样，用锌结合的hLOXL2进行酶促试验，结果是检测不到活性，表明当前结构中存在潜在的前体状态，去除锌对hLOXL2的活性没有明显影响。

有趣的是，离子交换或铜负载有力地刺激了hLOXL2的活性，这无疑被β-氨基丙腈（BAPN）所抑制，这是LOX家族的已知抑制剂，Michaelis常数（Km）和kcat的测定进一步证实了铜激活的hLOXL2的底物亲和性和催化周转率。

此外，离子交换未能增强铜结合点突变体的活性，总的来说，酶学检测加强了铜在激活hLOXL2中的作用，并在功能上支持当前结构处于锌结合的前体状态。

hLOXL2的假定活性部位的一个意外特征是Lys653和Tyr689之间有16.6?的距离，这是hLOXL2的LTQ前体，高质量的密度图确保了Lys653和Tyr689的局部模型建立的准确性，此外，这两个残基都没有参与包装界面，排除了对晶体包装的可能干扰，该结构观察表明，要么用于结晶的重组蛋白不能形成LTQ，要么蛋白质的成熟需要与当前结构有明显的构象变化。

结语

铜和醌依赖的胺氧化酶被分为两个非同源的家族： CAO和LOX，CAO是典型的同源二聚体酶，每个单体包括N端α/β结构域和一个催化结构域，催化结构域折叠成一个大的反平行的β三明治结构，两个β-毛刺臂从催化结构域延伸出来，拥抱其对立的伙伴，并帮助稳定同源结构，TPQ和铜结合位点位于三明治的相对β片上，并被埋在底物通道中。

与CAO相比，hLOXL2的结构显示出一种单体状态，此外，正如结构排列所示，目前hLOXL2的结构与CAO的结构没有整体的相似性，LOXL2的催化结构域折叠成一个小的β-三明治核心，它被三个额外的片段所包围，并被广泛的二硫桥稳定。

在目前的hLOXL2结构中，铜结合位点被锌占据，从而阻碍了蛋白质的激活，锌被Tyr689和来自结构核心外围的连续的β发夹的His残基协调，相反，CAO的铜结合图案中的一个组氨酸是从主序列中一个遥远的位置被招募的，然而，在前体LOXL2和apo CAO中，活性部位的金属配合的四面体几何结构是相似的。

值得注意的是，在具有 "非铜 "TPQ构象的holoCAO的结构中，TPQ不再作为铜配体，使其C5原子可以被底物攻击，在这种构象中，铜被保守的组氨酸和两个水分子（轴向和赤道上的水）协调，表现出一个方形金字塔的几何结构。

总的来说，了解酶的成熟机制对于揭示其激活过程和调控机制至关重要，而前体状态下人溶菌酶-2（hLOXL2）的晶体结构研究为我们深入了解其功能、调控机制以及相关疾病的治疗提供了重要线索。

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